摘 要
本研究以衰老綠蘿（Epipremnum aureum）葉片為材料，通過(guò)Dual-PAM/F熒光儀同步測(cè)定葉綠素?zé)晒夂蚉700?吸收信號(hào)，發(fā)現(xiàn)衰老葉片在照光后穩(wěn)態(tài)熒光（Fs）出現(xiàn)顯著低于暗適應(yīng)初始熒光（Fo）的“超淬滅”現(xiàn)象，且幅度與最大熒光（Fm）相當(dāng)。對(duì)比健康金魚(yú)吊蘭（Nematanthus wettsteinii）葉片的熒光動(dòng)態(tài)，結(jié)合熒光參數(shù)分析表明：衰老綠蘿葉片的超淬滅與非光化學(xué)猝滅（NPQ）的異常增強(qiáng)、光化學(xué)效率（Y(II)）的顯著下降及受體側(cè)限制（Y(NA)）的升高密切相關(guān)。機(jī)制上，這一現(xiàn)象可能源于衰老過(guò)程中光合機(jī)構(gòu)解體引發(fā)的高效熱耗散機(jī)制、狀態(tài)轉(zhuǎn)換的過(guò)度激活、PSⅡ反應(yīng)中心氧化態(tài)（P680?）的異常積累，以及葉綠體降解產(chǎn)生的新型淬滅劑作用。本研究為理解葉片衰老過(guò)程中光合機(jī)構(gòu)的應(yīng)激調(diào)控提供了新視角。
關(guān)鍵詞：葉綠素?zé)晒?；超淬滅；植物衰?/span>
Abstract
In this study, using senescent leaves of Epipremnum aureum as materials, chlorophyll fluorescence and P700? absorption signals were simultaneously measured by a Dual-PAM/F fluorometer. It was found that the steady-state fluorescence (Fs) of senescent leaves after illumination showed a "superquenching" phenomenon, which was significantly lower than the dark-adapted initial fluorescence (Fo), with an amplitude comparable to the maximum fluorescence (Fm). By comparing the fluorescence dynamics of healthy leaves of Nematanthus wettsteinii and combining with fluorescence parameter analysis, it was indicated that the superquenching in senescent Epipremnum aureum leaves was closely related to the abnormal enhancement of non-photochemical quenching (NPQ), the significant decrease in photochemical efficiency (Y(II)), and the increase in acceptor-side limitation (Y(NA)). Mechanistically, this phenomenon may result from efficient heat dissipation mechanisms induced by the disintegration of photosynthetic apparatus during senescence, overactivation of state transitions, abnormal accumulation of the oxidized state of PSⅡ reaction centers (P680?), and the action of new quenchers produced by chloroplast degradation. This study provides a new perspective for understanding the stress regulation of photosynthetic apparatus during leaf senescence.
Key words: Chlorophyll fluorescence; Super quenching; Plant Senescence
引 言
葉綠素?zé)晒夥治鍪墙沂竟夂蠙C(jī)構(gòu)功能狀態(tài)的有效工具，其中暗適應(yīng)初始熒光（Fo）反映PSⅡ反應(yīng)中心完全開(kāi)放時(shí)的基礎(chǔ)熒光，穩(wěn)態(tài)熒光（Fs）則代表光適應(yīng)下的熒光水平，通常介于Fo與最大熒光（Fm）之間（Schreiber et al., 1998）。近年來(lái)，部分研究發(fā)現(xiàn)脅迫或衰老葉片中Fs可能低于Fo（Flexas et al., 2002；Belyaeva et al., 2019），但該“超淬滅”現(xiàn)象的機(jī)制尚未明確。
葉片衰老伴隨葉綠素降解、PSⅡ反應(yīng)中心損傷及碳同化能力下降（Lim et al., 2007），可能導(dǎo)致過(guò)剩光能積累，進(jìn)而激活非光化學(xué)淬滅（NPQ）等保護(hù)機(jī)制（Demmig-Adams & Adams, 1992）。此前研究表明，衰老葉片的NPQ可能異常增強(qiáng)（Guo et al., 2018），但NPQ是否足以解釋Fs遠(yuǎn)低于Fo的極端現(xiàn)象仍存爭(zhēng)議。此外，我們推測(cè)光合機(jī)構(gòu)解體可能產(chǎn)生新型淬滅劑（如游離葉綠素或變性蛋白），或PSⅡ反應(yīng)中心氧化態(tài)（P680?）的壽命延長(zhǎng)，均可能參與超淬滅。
本研究以衰老綠蘿葉片為對(duì)象，結(jié)合健康金魚(yú)吊蘭葉片作為對(duì)照，通過(guò)同步分析葉綠素?zé)晒夂蚉700?信號(hào)，揭示Fs超淬滅現(xiàn)象的特征及潛在機(jī)制，為葉片衰老的光合調(diào)控研究提供理論依據(jù)。
材料與方法
1. 植物材料與生長(zhǎng)條件
選取室內(nèi)自然光環(huán)境中生長(zhǎng)的綠蘿（Epipremnum aureum）早期衰老葉片（葉片發(fā)黃，F(xiàn)v/Fm≈0.341）和室內(nèi)靠窗位置生長(zhǎng)的金魚(yú)吊蘭（Nematanthus wettsteinii）健康葉片（每日受約1000 μmol·m?2·s?1光照，F(xiàn)v/Fm≈0.827）。光照強(qiáng)度由ULM-500手持式PAR輻射儀（Heinz WALZ, GmbH）測(cè)定。
2. 葉綠素?zé)晒馀cP700?吸收測(cè)量
采用Dual-PAM/F光纖版雙通道葉綠素?zé)晒鈨x（Heinz WALZ, GmbH）同步測(cè)量葉綠素?zé)晒馀cP700?吸收信號(hào)。葉片暗適應(yīng)20分鐘后進(jìn)行光誘導(dǎo)與暗馳豫測(cè)量。綠蘿葉片采用60 μmol·m?2·s?1光化光照射，記錄熒光動(dòng)力學(xué)曲線并監(jiān)測(cè)暗馳豫；金魚(yú)吊蘭葉片采用750 μmol·m?2·s?1光化光照射，其余條件相同。通過(guò)Dual-PAM軟件計(jì)算Fo、Fs、Fm、Fv/Fm、Y(II)、qP、NPQ以及P700?吸收等參數(shù)，并將所有熒光與P700曲線分別以Fo、Fm和Po、Pm歸一化處理。
3. 數(shù)據(jù)處理
采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和圖形繪制。
結(jié)果與分析
1. 葉綠素?zé)晒夂?/span>P700+誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)
如圖1所示，綠蘿衰老葉片與金魚(yú)吊蘭健康葉片在照光初期的熒光動(dòng)力學(xué)存在較大差異。在綠蘿衰老葉片中，照光后Fs快速下降，并顯著低于暗適應(yīng)初始熒光Fo，其最低值約達(dá)到歸一化后-Fm的水平。暗馳豫過(guò)程中，F(xiàn)s逐漸回升，但在觀察時(shí)間內(nèi)仍未恢復(fù)至Fo水平。相比之下，金魚(yú)吊蘭健康葉片的Fs始終介于Fo與Fm之間，基本未出現(xiàn)超過(guò)Fo的下降，僅在暗馳豫初期出現(xiàn)短暫且幅度很小的下降。這些結(jié)果表明，衰老葉片存在明顯的Fs超淬滅現(xiàn)象，其幅度遠(yuǎn)大于健康葉片的正常淬滅行為。P700?吸收動(dòng)力學(xué)可以看出，光下綠蘿衰老葉片低于金魚(yú)吊蘭健康葉片，表明其電子傳遞鏈處于相對(duì)還原狀態(tài)。
圖1 葉綠素?zé)晒馀cP700?誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)及暗馳預(yù)曲線。上圖為葉綠素?zé)晒庑盘?hào)，紅色曲線為綠蘿早期衰老葉片，Fv/Fm為0.341，使用60μmol·m?2·s?1的光化光測(cè)量；黑色曲線為金色吊籃健康葉片，Fv/Fm為0.827，使用750μmol·m?2·s?1的光化光測(cè)量。兩條曲線均以Fo，Fm和Po，Pm進(jìn)行歸一化。下圖為同步記錄的P700?信號(hào)。
2. 熒光參數(shù)對(duì)比
進(jìn)一步分析熒光參數(shù)可揭示超淬滅背后的能量分配特征（圖2）。首先，PSII方面，最大光化學(xué)效率Fv/Fm和實(shí)際光化學(xué)效率Y(II)在衰老葉片中顯著降低。即便在弱光下，衰老綠蘿葉片的Y(II)在照光過(guò)程中持續(xù)較低，平均值約為0.06±0.03，而金魚(yú)吊蘭葉片平均為0.16±0.05，表明前者PSII反應(yīng)中心的結(jié)構(gòu)與功能均嚴(yán)重受損。盡管Y(II)較低，衰老綠蘿葉片的光化學(xué)猝滅系數(shù)qP和qL卻保持較高水平（均值約0.35±0.04），明顯高于金魚(yú)吊蘭（0.15±0.03），表明衰老葉片PSII反應(yīng)中心仍維持較高的開(kāi)放比例。這意味著衰老葉片吸收的光能無(wú)法通過(guò)正常光化學(xué)反應(yīng)消耗，而是以其他形式耗散。PSI方面，衰老葉片的Y(ND)（供體側(cè)限制）較低，但Y(NA)（受體側(cè)限制）較高，提示受體側(cè)也就是暗反應(yīng)的電子利用能力可能是衰老葉片光合作用的主要限制因素。
在非光化學(xué)淬滅方面，衰老綠蘿葉片表現(xiàn)出極高的NPQ和Y(NPQ)。弱光（60 μmol·m?2·s?1）照射便能誘導(dǎo)綠蘿葉片出現(xiàn)顯著NPQ峰值（約2.028），而金魚(yú)吊蘭葉片NPQ在強(qiáng)光750 μmol·m?2·s?1下才達(dá)到類似水平。這表明衰老葉片中的熱耗散機(jī)制極度活躍，弱光便可高度激活。綜合而言，衰老葉片吸收的光能主要通過(guò)NPQ強(qiáng)力耗散，而光化學(xué)轉(zhuǎn)化大幅削弱。
上述現(xiàn)象表明，綠蘿衰老葉片處于一種極度不平衡的能量分配狀態(tài)：PSII中心大量開(kāi)放（高qP）但光化學(xué)效率低下（低Y(II)），過(guò)剩的激發(fā)能被迫通過(guò)NPQ通路迅速散逸，導(dǎo)致Fs下降到Fo以下。同時(shí)，PSI方面衰老葉片的Y(NA)（受體側(cè)限制）升高，暗示PSI受體側(cè)電子傳遞受阻，這也可能加劇了電子傳遞鏈的還原態(tài)。總之，綠蘿衰老葉片的PSII功能受損，PSI受體側(cè)功能受損更嚴(yán)重，但維持了非光化學(xué)淬滅等光保護(hù)機(jī)制高效運(yùn)轉(zhuǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確了衰老葉片中Fs超淬滅現(xiàn)象與較強(qiáng)的非光化學(xué)淬滅和較低的光化學(xué)效率密切相關(guān)。
討 論
1. 衰老綠蘿葉片F(xiàn)s超淬滅的特征與特殊性
本研究發(fā)現(xiàn)，衰老綠蘿葉片的Fs超淬滅具有以下特征：（1）幅度極端（達(dá)-Fm水平），遠(yuǎn)超健康葉片的常規(guī)淬滅；（2）對(duì)弱光敏感，在60μmolm?2s?1光強(qiáng)下即可誘導(dǎo)；（3）伴隨NPQ的快速激活與恢復(fù)。這些特征與裸子植物的輕度淬滅及健康葉片的光化學(xué)淬滅（Flexas et al., 2002）存在本質(zhì)差異，表明衰老綠蘿葉片可能啟動(dòng)了特殊的淬滅機(jī)制。
2. 超淬滅現(xiàn)象的潛在機(jī)制
（1）非光化學(xué)淬滅（NPQ）的異常增強(qiáng)
綠蘿衰老葉片的NPQ在弱光下即達(dá)強(qiáng)光水平，且Y(NPQ)升高，表明調(diào)節(jié)性熱耗散（如葉黃素循環(huán)）過(guò)度激活。衰老導(dǎo)致碳同化能力下降，電子傳遞鏈?zhǔn)茏枋诡惸殷w腔酸化（ΔpH升高），觸發(fā)紫黃質(zhì)向玉米黃質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)天線色素的熱耗散（Gilmore, 1997）。這與光合能力下降背景下光保護(hù)機(jī)制代償性增強(qiáng)的假設(shè)一致。
（2）狀態(tài)轉(zhuǎn)換機(jī)制
狀態(tài)轉(zhuǎn)換作為光合機(jī)構(gòu)平衡光系統(tǒng)Ⅰ（PSI）與光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）激發(fā)能分配的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制，可能在衰老葉片的超淬滅中發(fā)揮作用。在藍(lán)細(xì)菌（如Synechocystis sp. PCC 6803）中，狀態(tài)轉(zhuǎn)換通過(guò)藻膽體（PBS）的移動(dòng)或與光系統(tǒng)的結(jié)合狀態(tài)改變實(shí)現(xiàn)：當(dāng)PSⅡ激發(fā)過(guò)剩時(shí)，PBS從PSⅡ解離并優(yōu)先結(jié)合PSI（狀態(tài)2），減少PSⅡ的激發(fā)能輸入導(dǎo)致Fs降低（Calzadilla & Kirilovsky, 2020；Pfennig et al., 2024）。這種調(diào)節(jié)依賴質(zhì)體醌（PQ）庫(kù)的還原狀態(tài)——衰老葉片中電子傳遞鏈?zhǔn)茏鑼?dǎo)致PQ過(guò)度還原，可能異常激活狀態(tài)轉(zhuǎn)換，促使更多天線色素與PSI結(jié)合，直接降低PSⅡ的熒光產(chǎn)量（Fs）。
本研究中，衰老綠蘿葉片的PSI受體側(cè)限制（Y(NA)）升高，暗示PSI電子傳遞受阻，可能反饋增強(qiáng)狀態(tài)轉(zhuǎn)換向狀態(tài)2的傾斜。結(jié)合藍(lán)細(xì)菌的模型（Pfennig et al., 2024），這種傾斜會(huì)通過(guò)兩個(gè)途徑加劇超淬滅：一是PSⅡ天線色素減少導(dǎo)致基礎(chǔ)熒光（Fo）貢獻(xiàn)降低；二是PSI結(jié)合的天線色素通過(guò)非光化學(xué)途徑（如葉黃素循環(huán)協(xié)同作用）強(qiáng)化熱耗散，使Fs進(jìn)一步低于Fo。此外，衰老葉片中高qP與低Y(II)的矛盾，可能與狀態(tài)轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的PSⅡ反應(yīng)中心“空開(kāi)放”（即開(kāi)放但無(wú)有效光化學(xué)轉(zhuǎn)化）相關(guān)，這些中心成為激發(fā)能淬滅的額外位點(diǎn)，進(jìn)一步壓低熒光信號(hào)。
因此，狀態(tài)轉(zhuǎn)換的異常激活可能是衰老葉片超淬滅的重要補(bǔ)充機(jī)制，其與NPQ、P680?積累的協(xié)同作用，共同導(dǎo)致了Fs的極端下降。
（3）PSⅡ反應(yīng)中心氧化態(tài)（P680?）的積累
盡管P680?壽命通常較短（微秒級(jí)），但衰老葉片中PSⅡ修復(fù)機(jī)制（如D1蛋白合成）受損，可能導(dǎo)致P680?還原受阻、壽命延長(zhǎng)（Melis, 1999）。P680?作為強(qiáng)淬滅劑，可通過(guò)非輻射能量轉(zhuǎn)移壓低熒光信號(hào)，與衰老綠蘿葉片高qP（反應(yīng)中心開(kāi)放）但低Y(II)（光化學(xué)效率低）的矛盾現(xiàn)象一致——開(kāi)放的反應(yīng)中心可能因P680?積累而無(wú)法有效利用光能。
（4）葉綠體降解產(chǎn)生的新型淬滅劑
衰老伴隨葉綠體結(jié)構(gòu)解體，釋放游離葉綠素、變性蛋白或膜碎片，這些物質(zhì)可能形成高效淬滅復(fù)合體。例如，游離葉綠素與蛋白的非特異性結(jié)合可增強(qiáng)激發(fā)能的熱耗散（Horton et al., 1996），這可能是綠蘿葉片超淬滅幅度極端的關(guān)鍵原因。此外，綠蘿葉片Y(NA)升高提示PSI受體側(cè)受限，過(guò)剩電子可能引發(fā)活性氧積累，進(jìn)一步加劇光合機(jī)構(gòu)降解與淬滅劑釋放。
3. 生理意義：衰老葉片的應(yīng)急能量卸載策略
衰老葉片在光合能力嚴(yán)重下降（Fv/Fm=0.341）的情況下，通過(guò)超淬滅快速卸載過(guò)剩光能，可能是避免光損傷的最后防御機(jī)制。高qP表明反應(yīng)中心仍保持開(kāi)放，但其功能已從光化學(xué)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)向能量耗散，這種功能性冗余可能延長(zhǎng)衰老葉片的存活時(shí)間，為營(yíng)養(yǎng)回收爭(zhēng)取時(shí)間（Lim et al., 2007）。
研究展望
未來(lái)研究可從以下幾個(gè)方面進(jìn)一步探究衰老葉片超淬滅的本質(zhì)：首先，需要結(jié)合分子遺傳和代謝組學(xué)手段，明確葉綠體解體過(guò)程中釋放物質(zhì)（游離葉綠素、變性蛋白等）對(duì)淬滅的貢獻(xiàn)。其次，深入研究超淬滅現(xiàn)象的適應(yīng)價(jià)值，比較不同環(huán)境條件（光強(qiáng)、溫度、干旱等）和不同物種衰老葉片中超淬滅發(fā)生的差異，以揭示其生態(tài)意義。此外，可應(yīng)用高時(shí)間分辨率葉綠素?zé)晒夥治龅刃录夹g(shù)（如Multi-Color-PAM-II），更精確地表征衰老葉片中非光化學(xué)猝滅成分及能量分布的動(dòng)態(tài)變化。最后，應(yīng)構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，將光合電子傳遞、質(zhì)子流和熱耗散等因素整合模擬，以量化各種機(jī)制對(duì)超淬滅的影響。這些研究有助于系統(tǒng)完善超淬滅的理論框架，指導(dǎo)作物栽培中管理衰老葉片光環(huán)境，從而提高作物抗逆性和光合效率。
結(jié) 論
本研究在衰老綠蘿葉片和金魚(yú)吊蘭健康葉片中比較發(fā)現(xiàn)：衰老葉片在照光誘導(dǎo)下Fs迅速降低并遠(yuǎn)低于Fo，表現(xiàn)為明顯的超淬滅現(xiàn)象。衰老葉片同步伴有NPQ異常增強(qiáng)、PSII光化學(xué)效率下降、反應(yīng)中心高開(kāi)放和PSI受體側(cè)限制升高等特征。推測(cè)超淬滅現(xiàn)象主要源于衰老過(guò)程中葉綠體光合機(jī)構(gòu)功能退化和保護(hù)機(jī)制的共同作用：一方面強(qiáng)烈的葉黃素循環(huán)驅(qū)動(dòng)NPQ將大量光能耗散（高qE），結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)換機(jī)制的過(guò)度激活減少了PSII激發(fā)能的輸入，另一方面PSII中心P680?積累和葉綠體降解產(chǎn)物的出現(xiàn)提供了新型淬滅途徑。這一現(xiàn)象可能代表衰老葉片在光合能力衰退背景下的緊急能量卸載策略，有助于避免光損傷并延緩葉片衰亡?？傊?，葉綠素?zé)晒獬銣缈赡苁撬ダ先~片光合機(jī)構(gòu)退化與保護(hù)性調(diào)控共同作用的結(jié)果，未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合分子層面探究其具體機(jī)制及生態(tài)意義。
參考文獻(xiàn)
郭峰：上海澤泉科技股份有限公司，feng.guo@zealquest.com
